Tipos de ELISA

Los ensayos ELISA son una técnica utilizada en la biología molecular para detectar y cuantificar moléculas específicas, como proteínas y anticuerpos. El acrónimo ELISA significa "Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay", y se basa en la unión específica entre un anticuerpo y su antígeno correspondiente. Esta técnica ha sido crucial en el diagnóstico de enfermedades, la determinación de niveles de hormonas en sangre y la detección de proteínas de interés en investigación básica y aplicada.

En este artículo, vamos a describir los diferentes tipos de ensayos ELISA que existen, sus aplicaciones y ventajas, y las posibles limitaciones y factores a considerar al diseñarlos y ejecutarlos. Además, proporcionaremos información útil sobre cómo seleccionar los reactivos y protocolos adecuados para su experimento específico.

Tipos de ensayos ELISA:

1. ELISA directo:

   Este método se basa en la utilización de un anticuerpo primario unido covalentemente a una superficie sólida, como un pozo de una placa de 96 pocillos. El antígeno se une directamente al anticuerpo, y luego se detecta mediante la adición de un anticuerpo secundario unido a una enzima, que puede convertir un sustrato incoloro en un producto coloreado medible.

2. ELISA indirecto:

   En este caso, el antígeno se une primero a un anticuerpo primario que ha sido adsorbido a una placa de 96 pocillos. El anticuerpo secundario unido a una enzima se utiliza para detectar la unión antigénica. Este método tiene la ventaja de que el anticuerpo primario puede unirse a varios sitios disponibles en el antígeno, aumentando así la sensibilidad de la detección.

3. ELISA por competición:

   El antígeno se adsorbe en una placa de 96 pocillos y luego se incuba con el anticuerpo primario y un anticuerpo secundario unido a una enzima. Durante esta incubación, el anticuerpo primario y el anticuerpo secundario compiten por lugares de unión en el antígeno. Si el anticuerpo primario y el antígeno se han unido antes de la adición del anticuerpo secundario, la cantidad de enzima unida al antígeno disminuirá, resultando en una señal de detección más débil.

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4. ELISA sandwich:

   Este método implica la utilización de dos anticuerpos diferentes, uno para la captura del antígeno y otro para la detección, ambos unidos a una superficie sólida como una placa de 96 pocillos. El antígeno se une al anticuerpo delimitador y luego se detecta mediante la adición del anticuerpo secundario unido a una enzima. Este método es útil para la detección de antígenos que no tienen sitios suficientes para la unión de anticuerpos primarios y secundarios en los métodos indirectos y por competición.

5. ELISA inverso:

   Este método se basa en la identificación de anticuerpos específicos para una proteína de interés. En este método se adsorben los anticuerpos a la placa y luego se incuba con un extracto de tejido. La proteína de interés se une a sus anticuerpos específicos y los anticuerpos secundarios complementarios se usan para detectar la unión.

6. ELISA práctico:

   Este tipo de ELISA se utiliza generalmente con fines de diagnóstico en pacientes humanos y animales. Se utiliza para detectar específicamente anticuerpos anti-VIH. Este ELISA suele ser la primera prueba que se realiza para la identificación de anticuerpos, aunque el diagnóstico de VIH requiere una prueba confirmatoria adicional.

7. ELISA competitivo:

   El antígeno se adsorbe en una placa de 96 pocillos, y se incuba con una muestra de suero que contiene anticuerpos contra el antígeno. Se agrega un anticuerpo secundario etiquetado con una enzima, que puede unirse al anticuerpo primario. Si el antígeno y el anticuerpo primario están presentes en el suero, el anticuerpo secundario tendrá menos lugares de unión al anticuerpo primario, por lo que la cantidad de enzima unida al antígeno y la señal de detección asociada disminuirán.

8. ELISA de captura:

   Es el sandwich ELISA inverso, se utiliza generalmente para la determinación de la concentración de moléculas específicas en el medio biológico, tales como las citocinas, factores de crecimiento, enzimas, hormonas, y los marcadores tumorales. Los anticuerpos primarios y secundarios, ambos específicos para la molécula de interés, se fijan a la placa de pocillo y, después de la adición de la muestra, la molécula se detecta mediante el anticuerpo secundario marcado.

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9. ELISA enzimático:

   Los anticuerpos específicos para la proteína de interés se adsorben directamente a la placa de pocillos, o se fijan a una capa de proteína entera que se adsorbe a la placa. Después de la incubación con la muestra, se agrega un anticuerpo secundario conjugado a enzima que se une al anticuerpo primario. Una vez que se agrega el sustrato, este tipo de ELISA produce una señal fluorescente o cromógena.

10. ELISA fluorescente:

    En este método, los anticuerpos primarios conjugados a fluorocromo(o fluorescente), se adsorben a la placa de pocillos, y el suero del paciente o la muestra se incuba en la placa. La detección se realiza mediante lectura de fluorescencia de los anticuerpos unidos específicamente al antígeno. Este método permite la detección altamente sensible y específica, y se utiliza en la detección de agentes patógenos, tales como virus y bacterias.

11. ELISA cuantitativo:

    Es utilizado para medir la concentración de una molécula específica en una muestra. Este método es similar al sandwich ELISA, donde se utilizan anticuerpos primarios y secundarios, sin embargo, se utiliza una etapa de calibración para establecer una curva estándar de absorbancia en función de la concentración de la molécula estándar. Las concentraciones desconocidas se determinan mediante la interpolación de la curva estándar.

12. ELISA punto final:

    Este proceso permite la confirmación de la presencia de una proteína específica después de la amplificación del ADN. Para este ELISA, se utiliza una etapa de detección final que utiliza un anticuerpo específico para la proteína de interés unido a una enzima marcada, que se detecta mediante la adición de sustrato y determinación de la presencia o ausencia de una señal de detección.

13. ELISA en banda:

    Este método utiliza una matriz de tiras de nylon o nitrocelulosa, en las que los anticuerpos se han unido específicamente para capturar el antígeno de interés. El suero de la muestra se aplica a la tira, y después se agrega un anticuerpo secundario marcado para detectar la unión antigénica. Este método es útil para el diagnóstico rápido de infecciones virales, como dengue o zika.

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14. ELISA de doble antígeno:

    Este método se utiliza para la detección de anticuerpos contra virus, como el VIH. Se utilizan dos antígenos diferentes, el antígeno de prueba y el antígeno de captura. El antígeno de prueba se adsorbe a una placa de pocillo y se incuba con el suero del paciente. El anticuerpo se captura luego por un segundo anticuerpo que se ha unido a otra proteína, como la albúmina de suero bovino.

15. ELISA de prueba para la detección de hCG:

    Este método se utiliza para detectar la hormona del embarazo hCG en la orina o la sangre de una mujer embarazada. El anticuerpo se adhiere a la placa y se incuba con la muestra, y se utiliza un conjugado de anticuerpo-enzima para detectar la presencia de la hCG. Una ventaja de este método es que permite la detección temprana del embarazo.

16. ELISA de inmunización:

    Este método se utiliza para medir la respuesta de un animal o humano a la inmunización y para determinar los niveles de anticuerpos específicos (inmunoglobulina G, IgG) contra un antígeno particular en suero. La detección se realiza mediante la adición de un anticuerpo secundario marcado especifico para la IgG del hospedero.

17. ELISA in situ:

    Este método se utiliza para la identificación de células que producen una proteína específica en el tejido. Se utiliza un anticuerpo primario específico para la proteína de interés, que se visualiza con un anticuerpo secundario específico marcado unido a una enzima. La reacción de la enzima puede ser visualizada mediante una reacción de cromógeno o la reacción más común de inmunofluorescencia.

18. ELISA basado en células:

    Este método se utiliza para medir la detección de biomoléculas específicas en la superficie de la célula. El anticuerpo primario es detectado por la modificación de una molécula fluorescente y la cantidad de moléculas fluorescentes es proporcional a la concentración de la molécula de interés. Este método también se ha utilizado para demostrar señalización del receptor acoplada a proteína G y la actividad en células vivas.

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19. ELISA para la detección de drogas:

    Usando un tipo especifico de anticuerpo en la matriz del ELISA, se puede detectar la presencia de drogas en la orina o el suero del paciente. Una muestra incuba con el anticuerpo, que luego se detecta mediante la adición de un anticuerpo secundario específico para el anticuerpo primario y etiquetado con una enzima.

Preguntas frecuentes:

1. ¿Cómo se seleccionan los reactivos adecuados para un ensayo ELISA?

   Los reactivos para el ELISA deben ser seleccionados en base a la especificidad del anticuerpo, sensibilidad y compatibilidad. Se deben elegir anticuerpos que sean específicos para la proteína de interés, y que no se unan uniformemente a otras proteínas. La sensibilidad del ELISA puede ser evaluada por la capacidad de detectar proteínas en diferentes rangos de concentración. En cuanto a la compatibilidad, los reactivos como la concentración del tampón, el pH y los límites del tiempo de reacción deben ser previamente determinados y ajustados para la detección de la proteína de interés.

2. ¿Qué consideraciones de diseño son importantes para un ensayo ELISA?

   La disposición de los reactivos y la calidad es esencial al diseño de ELISA. La selección de los anticuerpos primarios y secundarios son críticos para los resultados exitosos, así como el tiempo de incubación, la concentración de los reactivos y el rendimiento adecuado del detector de fluorescencia o la lectura del espectrofotómetro. Finalmente un paso crítico es incluir controles para minimizar la posibilidad de resultados erróneos.

3. ¿Existen posibles limitaciones y desventajas de ELISA?

   Una posible limitación de ELISA es que la detección puede ser influenciada por la presencia de otros anticuerpos no relevantes, pueden presentar interferencia o pueden generar reacciones cruzadas. Además, algunos tipos de ELISA pueden requerir varias horas de incubación, lo que limita la cantidad diaria de muestras que se pueden analizar. Existen alternativas a los ELISA, pero estos también están bajo el desafío y las limitaciones del diagnóstico. Por lo tanto, asegurarse de seleccionar el tipo adecuado de ELISA y los reactivos correctos es esencial para garantizar una detección precisa.

4. ¿Qué técnicas de seguimiento se pueden utilizar después de detectar la unión antígeno-anticuerpo mediante ELISA?

   Entre el seguimiento posterior después de la detección de la unión antígeno-anticuerpo mediante ELISA, se incluyen Western blot, ensayos de actividad biológica, análisis de microarrays de proteínas, Zymography (para las enzimas) y la cromatografía de afinidad, que pueden ser utilizados para dianósticos con mayor especificidad y para la investigación básica y aplicada.

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5. ¿Es ELISA una técnica segura para los investigadores?

   La técnica de ELISA es segura siempre y cuando se utilicen los protocolos y las precauciones de bioseguridad adecuados durante la manipulación de muestras, los reactivos y los instrumentos de laboratorio. Esto incluye el uso de guantes, batas de laboratorio y protector ocular, y la eliminación adecuada de materiales contaminados EPI y reactivos caducados.

Conclusión:

Los ensayos ELISA son una herramienta clave en la detección y cuantificación de proteínas y anticuerpos en una amplia variedad de contextos biológicos. Hay muchos tipos diferentes de ELISA disponibles, cada uno de los cuales se puede adaptar para satisfacer las necesidades específicas de su experimento, pero sabiendo claramente las ventajas y desventajas de cada uno. La selección de los reactivos y el diseño adecuado del experimento son esenciales para garantizar la sensibilidad y la especificidad de los resultados.

Si bien hay ciertas limitaciones a esta técnica, que son importantes tener en cuenta, el ELISA sigue siendo uno de los más versátiles métodos de detección de proteínas y anticuerpos disponibles hoy y se usa en prácticamente

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